Cell ：万物可控！机器学习如何解锁蛋白质“开关”，开启活体按需功能调控新时代？

解锁生命“遥控器”：CAGE-Proxvivo 的核心原理

在CAGE-Proxvivo策略中，研究团队巧妙地将蛋白质的“开关”功能设计成了一套“笼子”（cage）与“钥匙”（key）系统。想象一下，一个微小的“笼子”被精巧地安装在蛋白质的关键位置，暂时“锁住”了它的功能。当需要激活蛋白质时，只需递送一把特定的“钥匙”，就能在活体环境中将“笼子”移除，让蛋白质重新“自由”，恢复其天然活性。

这项技术的关键在于引入了一种独特的非天然氨基酸（unnatural amino acid, ncAA）—— TCOY (trans-cyclooctene-caged tyrosine)。TCOY是一种被“笼子”包裹的酪氨酸（tyrosine）衍生物。当TCOY被遗传编码（genetically encoded）到蛋白质的活性位点（active site）或关键相互作用界面附近时，它庞大的体积会形成空间位阻（steric hindrance），有效抑制蛋白质的功能。

那么，如何“解开”这个“笼子”呢？研究团队选择了生物正交裂解反应（bioorthogonal cleavage reaction）中效率极高、对活体兼容性极强的 逆电子需求Diels-Alder反应 (inverse-electron-demand Diels-Alder reaction, IEDDA)。他们合成了一系列叠氮化四嗪（tetrazine, Tz）衍生物作为“钥匙”。实验发现，在所有测试的四嗪“钥匙”中，3,6-二甲基-1,2,4,5-四嗪（Me2Tz） 表现出最高的解笼效率，在实验条件下，仅需30分钟就能使TCOY的脱笼率达到惊人的80%以上。这意味着，Me2Tz能够快速、高效地“解锁”TCOY，从而恢复蛋白质功能。

与传统的光控方法相比，化学小分子（small molecule）介导的脱笼（decaging）具有无可比拟的优势，尤其是在活体应用中。小分子可以克服紫外光（UV light）穿透深度有限的问题，轻松到达小鼠体内的深层组织，实现对各种器官、细胞和生物过程的精准操控，真正做到“按需激活”。CAGE-Proxvivo的诞生，正是为解决活体环境中蛋白质调控的普适性与精准性难题而生。

“智慧”进化：机器学习如何加速生物发现

要将TCOY这个“笼子”精准地安装到目标蛋白质的特定位点，需要一种特异性的“工具”——氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS）。然而，自然界中并没有能够识别TCOY的aaRS，这意味着研究人员必须对现有的aaRS进行“定向进化”（directed evolution），改造它们使其能够特异性地识别TCOY，并将其连接到tRNA（转运RNA）上，最终通过遗传密码扩增（genetic code expansion, GCE）技术将TCOY插入到目标蛋白质中。

传统的aaRS定向进化是一个浩大且充满挑战的工程，它涉及到巨大的序列空间探索、复杂的功能筛选，就像在浩瀚的沙海中寻找一颗特定的珍珠。为了加速这一过程，研究团队引入了机器学习这一“智慧”助手。

他们构建了一个创新的机器学习流程：

数据收集与准备：首先，研究团队收集了117个已知的aaRS突变体库，并系统地筛选了七种酪氨酸类似物，评估它们与aaRS突变体之间的识别效率。初步测试发现，没有一个现有的aaRS突变体能有效识别TCOY。

特征提取与模型训练：他们将蛋白质序列数据（sequence-based features）和结构数据（structure-based features）结合起来。序列特征来源于最先进的蛋白质语言模型（protein language models），如UniRep（统一表征模型）和ESM（进深标度模型），这些模型能够从海量蛋白质序列中学习到蛋白质的内在规律。结构特征则通过AlphaFold2预测蛋白质结构，并利用RosettaLigand（罗斯塔配体）和CartesianDDG（笛卡尔差分增益）等计算方法，精确模拟aaRS与TCOY的相互作用能量和空间位阻。

所有这些特征被整合起来，输入到一个经过监督学习（supervised learning）训练的二元分类器（binary classifier）中。这个分类器能够根据输入特征，预测aaRS突变体识别TCOY的效率。

智能筛选与实验验证：模型根据预测的识别效率对aaRS突变体进行排名。研究团队选择了预测得分最高的12个PyIRS（pyrrolysine-aaRS）变体进行实验验证。最终成功筛选出两个能够高效将TCOY插入绿色荧光蛋白（GFP）的PyIRS突变体！

通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，研究人员进一步验证了TCOY成功编码到GFP中的高保真度（fidelity）以及Me2Tz诱导的脱笼效率。例如，带有TCOY笼子的GFP（GFP-N149TCOY）的预期分子量为27880 Da，经过Me2Tz处理后，成功脱笼产物GFP-N149-Y的分子量变为27772 Da，这与预期结果高度一致，证实了脱笼的有效性。此外，该技术还成功将TCOY插入活细胞膜上的视紫红质（rhodopsin）中，展示了其在膜蛋白（membrane proteins）应用上的巨大潜力。

这项工作首次将机器学习引入aaRS进化领域，不仅加速了特定非天然氨基酸的发现，更重要的是，它提供了一个通用框架，未来有望应用于更多类型非天然氨基酸的遗传编码，极大地拓展遗传密码扩增技术的应用范围。

从“沉睡”到“觉醒”：体内蛋白激活的魔力

有了能够精准编码和高效脱笼TCOY的工具，研究团队迫不及待地将CAGE-Proxvivo策略推向了活体动物实验。他们选择萤火虫荧光素酶（firefly luciferase, fLuc）作为模型蛋白，因为其生物发光（bioluminescent）强度能够直观地反映蛋白质的活性变化。

通过计算筛选，研究团队找到了fLuc催化口袋（catalytic pocket）附近的关键“锚定位点”（anchor sites）。他们发现，在fLuc的F250或Y255位点引入TCOY，可以有效抑制fLuc的活性。当对这些笼罩的fLuc进行化学脱笼后，其活性可以得到显著恢复。具体数据显示，fLuc-F250TCOY在脱笼后活性提高了10倍以上。

更令人兴奋的是活体实验结果。研究人员将表达TCOY笼罩fLuc变体（fLuc-F250TCOY）的HEK293T（人胚肾293T）细胞皮下移植到小鼠体内，形成异种移植模型（xenograft model）。随后，通过尾静脉注射（tail-vein injection）Me2Tz“钥匙”，成功在活体小鼠体内诱导了IEDDA反应，使fLuc活性得到显著恢复，小鼠体内的生物发光强度随之升高。

CAGE-Proxvivo的潜力远不止于此。研究团队进一步将其应用于一种强大的治疗性蛋白质——炭疽致死因子（anthrax lethal factor, LF）。LF是炭疽毒素（anthrax toxin）的关键组分，能够通过裂解促分裂素原活化蛋白激酶激酶（MAPK kinase, MEK3）诱导细胞凋亡（apoptosis）。然而，直接使用LF具有全身毒性。研究团队巧妙地将LF的活性位点（Y659）笼罩，形成LF-Y659TCOY。

为了实现肿瘤特异性激活，他们将LF-Y659TCOY与表皮生长因子-保护性抗原（EGF-PA）融合。EGF-PA能够特异性靶向过表达表皮生长因子受体（EGFR）的肿瘤细胞。实验证明，这种笼罩的LF-Y659TCOY仅在EGFR过表达的A431（人表皮样癌）细胞中，且在Me2Tz脱笼后才引起MEK3的裂解和细胞死亡，而对EGFR缺陷的A375细胞则没有影响。

在活体肿瘤模型中，CAGE-Proxvivo展示了其强大的抗肿瘤潜力。将表达EGFR的A431细胞移植到小鼠体内形成肿瘤。通过腹腔注射（intraperitoneal injection）EGF-PA/LF-Y659TCOY，并在一天后尾静脉注射Me2Tz，成功在肿瘤部位激活LF。实验结果显示，经EGF-PA/LF-Y659TCOY结合Me2Tz治疗的小鼠，肿瘤生长受到了显著抑制，肿瘤体积在整个实验周期内均远小于对照组小鼠。这表明CAGE-Proxvivo能够实现肿瘤细胞特异性激活，有效杀伤肿瘤。

更值得关注的是，研究团队还利用CAGE-Proxvivo成功诱导了肿瘤细胞的细胞焦亡（pyroptosis）。细胞焦亡是一种伴随炎症（inflammatory）反应的程序性细胞死亡，能够释放多种细胞因子，激活机体的抗肿瘤免疫（antitumor immunity）。实验数据显示，LF处理可以诱导小鼠肺癌LLC细胞发生细胞焦亡，表现为显著的乳酸脱氢酶（LDH）释放、碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色阳性、半胱天冬酶-8（caspase-8）和半胱天冬酶-3（caspase-3）的激活以及膜蛋白焦亡素E（GSDME）的裂解。在活体小鼠中，肿瘤部位的LF激活导致CD3阳性T细胞（CD3+ T cells）和CD8阳性T细胞（CD8+ T cells）等免疫细胞数量显著增加，并进一步抑制了肿瘤生长。这为开发新型免疫疗法（immunotherapy）提供了新的思路。

精准“把脉”：调控蛋白间相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions, PPIs）是所有生命活动的核心，它们调控着细胞信号传导（cell signaling）、基因表达（gene expression）以及抗体-抗原识别（antibody-antigen recognition）等关键过程。精准调控PPIs对于理解疾病机制和开发靶向药物至关重要。

研究团队进一步将CAGE-Proxvivo策略拓展到PPIs的调控。通过对331个已知PPI界面的氨基酸丰度（amino acid abundance）和结合亲和力（binding affinity）影响进行分析，研究人员发现，酪氨酸（tyrosine） 在PPI界面中出现的频率较高，且将其突变为其他氨基酸对蛋白质稳定性的影响最小。这证实了酪氨酸是PPI操作中理想的“界面笼子”（interface cage）残基。

为了验证这一概念，他们使用了裂解型荧光素酶（split fLuc）作为报告系统。研究团队发现，在fLuc的界面位点（如I423和F465）引入TCOY，可以有效抑制其相互作用，而Me2Tz的加入则能使其恢复活性，激活效率均达到10倍以上。

随后，研究团队将CAGE-Proxvivo应用于调控肿瘤免疫（tumor-immune）界面的关键PPI——程序性死亡受体1（PD-1）与其配体PD-L1（PD-L1）之间的相互作用。PD-1/PD-L1通路是肿瘤细胞逃避宿主免疫清除的重要检查点。实验结果显示，在PD-L1的Y123位点引入TCOY（PD-L1-Y123TCOY）后，其与PD-1的结合几乎完全被阻断，导致T细胞报告系统中的荧光素酶活性显著增强，表明检查点抑制被解除。而当加入Me2Tz进行脱笼后，PD-1/PD-L1的结合得到恢复，T细胞活性恢复到与野生型PD-L1相似的抑制水平。这充分证明了CAGE-Proxvivo能够精确地化学调控细胞表面的PPIs，为肿瘤免疫检查点（immune checkpoint）调控提供了新策略。

“智能”抗癌：生物正交门控抗体引发免疫风暴

在肿瘤治疗领域，T细胞衔接器（T cell engager, TCE）双特异性抗体（bispecific antibody）因其能够募集T细胞攻击肿瘤细胞而备受关注。然而，传统TCEs的潜在脱靶毒性（off-target toxicity）和全身性细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）是其临床应用的主要障碍。为了提高安全性，研究团队提出了一种“逻辑门”（logic gate）策略，即T细胞的激活必须满足多个条件才能开启。

CAGE-Proxvivo为实现这种“门控”抗体（gated antibody）提供了理想的平台。他们设计了一种生物正交门控的抗CD3抗体（anti-CD3 antibody, aCD3），通过TCOY笼罩来控制其与T细胞表面CD3抗原的结合。研究团队以靶向HER2（人表皮生长因子受体2）的ZHER2-aCD3抗体为例进行验证。

他们发现，在aCD3的Y59位点引入TCOY（ZHER2-aCD3-Y59TCOY），几乎可以完全阻断其与CD3的结合，而Y103位点笼罩的抗体仅部分阻断。这使得T细胞在没有Me2Tz“钥匙”时，即使遇到肿瘤细胞，也不会被异常激活，从而降低了全身性毒性。当Me2Tz被注射到肿瘤部位后，Y59位点的TCOY被高效脱笼，抗体恢复了与CD3的结合能力，并以高荧光恢复率证实了结合的恢复。

活体实验进一步印证了门控抗体的优势。研究团队在小鼠模型中观察到，与传统TCEs相比，ZHER2-aCD3-Y59TCOY显著降低了小鼠血清中白介素-6（IL-6）和干扰素-γ（IFN-γ）等炎性细胞因子（inflammatory cytokine）的水平，这预示着更低的CRS风险，提高了治疗安全性。同时，化学脱笼后的ZHER2-aCD3-Y59TCOY显著促进了T细胞向肿瘤组织的浸润（infiltration），并有效抑制了肿瘤生长。在NOD-SCID（非肥胖糖尿病-严重联合免疫缺陷）小鼠模型中，ZHER2-aCD3-Y59TCOY与Me2Tz的联合治疗，使得肿瘤体积得到了显著抑制，肿瘤增长速度远低于对照组。

这项工作还展示了CAGE-Proxvivo的通用性。除了酪氨酸，研究团队还成功地将另一种重要的非天然氨基酸——TCO-半胱氨酸（TCO-cysteine, TCOC）进行遗传编码。半胱氨酸（cysteine）在蛋白质功能中扮演着多种重要角色。通过机器学习辅助，他们同样找到了能够高效识别TCOC的PyIRS变体，并验证了其在活体细胞中激活海肾荧光素酶（Renilla luciferase, RLuc）的能力。TCOC的成功编码，进一步证明了CAGE-Proxvivo作为通用平台的强大潜力。

开启生物医学新纪元

CAGE-Proxvivo策略的成功开发，是蛋白质工程和化学生物学领域的里程碑。它实现了在活体小鼠体内对蛋白质功能、蛋白质-蛋白质相互作用的按需精准化学调控，其核心优势在于：

普适性：该平台能够适用于多种不同类型的蛋白质，包括酶（enzymes）、受体（receptors）和抗体（antibodies）等。

活体兼容性：化学小分子诱导的脱笼克服了传统光控技术的组织穿透深度限制，使得深层组织和器官的蛋白质调控成为可能。

机器学习赋能：首次将蛋白质语言模型与结构建模相结合，极大地加速了非天然氨基酸遗传编码体系的开发效率，为未来更广泛的非天然氨基酸应用奠定基础。

精准调控：无论是激活单个蛋白质的功能，还是调控复杂的蛋白质相互作用网络，CAGE-Proxvivo都能提供高精度的时空控制。

这项技术不仅为基础生物学研究提供了强大的“功能获得性研究”（gain-of-function study）工具，帮助研究人员更深入地理解复杂生命过程的动态变化，更在转化医学（translational medicine）领域展现出巨大的应用前景。例如：

新型前药（prodrug）设计：将药物活性组分以笼罩形式递送，仅在病灶部位（如肿瘤）激活，从而最大程度地降低全身毒副作用，提高治疗效率。

精准免疫疗法：开发“门控”抗体和T细胞衔接器，在特定条件下激活免疫细胞，避免脱靶效应和细胞因子风暴。

其他疾病治疗：该平台有望应用于自身免疫性疾病（autoimmune diseases）、神经退行性疾病（neurodegenerative disorders）和代谢性疾病（metabolic conditions）等领域，实现对异常蛋白质功能的精准干预。

当然，CAGE-Proxvivo策略仍有提升空间，例如进一步扩展非天然氨基酸的种类、优化小分子触发器的药代动力学（pharmacokinetics）特性以及提高蛋白质在活体内的递送效率等。但毫无疑问，这项创新成果为我们提供了一个前所未有的窗口，去探索生命的奥秘，并为攻克人类疾病带来新的希望。

未来，我们或许真的能手握“遥控器”，在生命舞台上，精准地编织出我们期待的华章！